体外诊断试剂临床试验中执行EP09c统计分析的方法探讨

来源期刊：广州医药 | 818-828 发布时间：2026-07-20 收稿时间：2026/8/20 17:24:10 阅读量：19

作者：: 何帆,

荆俊鹏,

姜烈君,

莫志江,

谭春艳,

周莹,

关键词：: 体外诊断试剂 EP09c 差异图散点图偏倚; in vitro diagnostic reagent（IVDR）EP09c difference plot scatter plot bias

DOI：: 10. 20223 / j. cnki. 1000-8535. 2026. 07. 004

收稿时间：: 2025-11-12
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目的在体外诊断试剂（IVDR）临床试验中，准确快速地完成EP09c的统计分析工作。方法利用MedCalc软件对差异图（Difference Plot）执行偏倚量化；利用SPSS或MedCalc软件的回归模型对散点图（Scatter Plot）执行偏倚量化；差异图和散点图被用于确认偏倚量化结果的正确性。结果 MedCalc的差异图确定工作样本的低浓度数据符合恒定标准差分布，偏倚为0.10（0.09，0.28）；高浓度数据符合恒定变异系数分布，偏倚为-5.0%（中位数：-7.2%，1.5%）或-3.2%（Hodges-Lehmann中位数：-5.5%，-0.8%）。散点图确认Passing&Bablok回归和加权线性回归（权重1/x_i ^1.4）适用于工作样本的数据，回归方程分别为y=0.122+0.952x（R²=0.983）和y=0.269+0.977^x（R²=0.981）。结论偏倚量化结果必须得到差异图和散点图的确认，否则结果的正确性无法保证。

《用患者样本进行方法比对及偏倚评估，第三版》（EP09c，3rd Ed）由美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）于2018年发布，是临床实验室评估两个定量检测系统（方法）之间偏倚的指导性文件^［1］，其统计分析方法在药物临床试验质量管理规范（Good Clinical Practice，GCP）的体外诊断试剂（in vitro diagnostic reagents，IVDR）临床试验中被广泛使用，内容为偏倚量化，即选择合适的量化指标（差值或差值%）和统计模型估算试验方法与对照方法之间的偏倚及其95%置信区间（95% confidence interval，95%CI），与EP21-A或EP21-ed2（医学实验室定量测量方法总分析误差的评估）共同用于IVDR的一致性评价^［2］。由于EP09c内容涉及大量统计学概念和复杂难懂的公式，计算量庞大，且均基于手工计算，难以完全正确解读和执行。在实际操作中，以下问题普遍可见：（1）直接删除离群值，绝大多数对原因不进行探究，亦不采用可处理离群值的非参数方法；（2）未对差值或差值%计算偏倚及其95%CI，也未按EP09c规则判断结果；（3）Bland-Altman图呈恒定变异系数（coefficient of variation，CV）分布时使用差值而不是差值%来量化偏倚；（4）未能依据数据分布特点（散点图）选择恰当的回归模型，一律采用普通线性回归。目前，国家三级公立医院绩效考核中，GCP临床试验项目是重要组成部分^［3］，分析方法不正确将直接导致研究结论不可靠，得到误导性的结果。本文按照EP09c流程演示数据统计分析方法，并指出一些常见的错误，希望能为GCP研究人员规范、高效、正确分析数据提供帮助。

1 资料与方法

1.1 实例数据来源

鉴于单份实测数据难以全面涵盖常见问题，因此用非实测数据（表1）评价新、旧批号试剂的可替换性。该模拟数据并非通过统计模型（如正态分布模型、指数模型等）产生，而是通过实测数据改造，制造了一个明显的离群值（第85号数据），使数据偏离正态分布，以拓展数据分析方法的通用性。本实例数据汇集了数据分析中容易出错的问题，具有一定的代表性。本研究方案经医院伦理委员会审批通过（伦理批件号：KY-ZC-2024-120号）。

表1 某生物标志物新、旧批号试剂单次检测的模拟结果单位：ng/L

序号(i)a	旧批号（X）	新批号（Y）	序号(i)a	旧批号（X）	新批号（Y）	序号(i)a	旧批号（X）	新批号（Y）
1	0.3	0.1	31	10.2	9.3	61	156.4	148.6
2	0.4	0.1	32	10.9	9.5	62	156.9	149.9
3	0.2	0.3	33	11.4	10.5	63	165.8	154.3
4	0.3	0.4	34	13.6	15.5	64	174.7	156.7
5	0.1	0.8	35	16.6	19.2	65	176.9	155.5
6	0.4	0.5	36	18.6	18.2	66	187.7	172.6
7	0.8	0.2	37	18.6	20.4	67	189.3	177.6
8	0.8	0.3	38	20.6	18.6	68	202.5	186.2
9	0.5	0.6	39	20.1	20.9	69	186.4	211.0
10	1.3	0.7	40	20.8	21.9	70	240.1	213.1
11	0.8	1.3	41	27.9	24.5	71	236.6	221.5
12	0.9	1.4	42	28.3	24.9	72	255.8	233.7
13	1.5	0.9	43	28.2	27.5	73	249.1	243.7
14	1.6	0.9	44	34.5	35.2	74	258.9	262.5
15	1.1	1.6	45	32.9	37.6	75	283.9	249.8
16	1.6	1.5	46	36.4	39.5	76	274.6	279.1
17	1.8	1.9	47	42.7	41.8	77	346.5	301.3
18	2.0	2.3	48	54.5	58.3	78	375.4	371.4
19	2.4	2.3	49	55.1	58.1	79	395.7	389.8
20	2.6	3.0	50	60.7	55.1	80	458.9	432.8
21	3.6	4.1	51	71.5	64.6	81	438.9	456.4
22	6.7	7.3	52	75.8	71.6	82	537.1	490.7
23	6.8	7.4	53	81.8	83.6	83	587.2	539.9
24	7.8	7.1	54	96.6	87.7	84	608.9	633.8
25	7.3	7.9	55	113.8	103.8	85	556.4	776.7
26	7.8	8.1	56	117.1	121.9	86	734.2	753.9
27	8.3	9.0	57	127.7	121.7	87	793.5	748.4
28	9.9	9.1	58	135.2	120.7	88	900.6	848.8
29	9.2	10	59	140.5	135.1	89	927.1	861.9
30	9.4	10	60	136.9	139.1	90	858.0	947.9
注：a为按Y和X的质量浓度均值排序。

1.2 可接受偏倚的确定

可接受偏倚（acceptable bias，AB）应该在研究设计阶段确定，可按照EP21-ed2、国家临检中心《临床检验室间质量评价计划》和行业标准等首先确定允许总误差（total allowable error，TEa或allowed total errors，ATE）^{［2，4-8］}，然后AB一般设定不超过TEa的1/2^{［2，9-10］}或根据生物变异^［11-12］设定。在促甲状腺激素（TSH）、三碘甲状腺原氨酸（T3）和和甲状腺素（T4）等免疫分析试剂的批间研究中，梅奥诊所的Katzman等^［13］将斜率（b）处于0.9~1.1、截距（a）＜50%可报告范围下限、批间平均差异＜10%、R²＞0.95作为可接受标准。批间平均差异属偏倚（以检测单位表达属恒定偏倚，以百分比表达为比例偏倚），b-1为比例偏倚、a为恒定偏倚^［14］，它们之间存在关联。批间平均差异＜10%与b处于0.9~1.1等效，两者不应冲突。免疫分析试剂批间差异较大，其他项目或需更严格的标准。

本文将AB设为±1 ng/L（恒定偏倚）或±10%（比例偏倚），可接受斜率为0.9~1.1。设置AB应考虑误差来源，例如试剂批号比对（考核试剂和对照试剂均在同一台仪器上测定）与检测系统比对（仪器和试剂均不相同），前者不涉及检测仪的变异，相对于后者应该需要更为严格的AB。值得注意的是，很多IVDR研究方案并没有预先制定AB或TEa^［2］，而是事后采用了不规范甚至是错误的评价标准。

1.3 统计学处理

采用SPSS 26.0和MedCalc 22.0统计软件，两者可以互为补充对方缺失的功能，涉及的统计模型为单样本符号秩和检验、单样本t检验和5个线性回归模型，以及权重估算模块（weight estimation module）和离群值探测模块（outlier detection module）等。

2 数据分析和结果

EP09c分析的主要流程为首先执行图形分析（图1~4），然后是偏倚量化（表2-4），前者是确证后者正确性的保证。EP09c的偏倚结果来自差值（或差值%）分析和回归分析两部分，其分析顺序无严格要求。以下为我们建议的EP09c数据分析流程。

2.1 差异图的偏倚量化

第一步是图形目视检查，其后是偏倚量化和结果判断。

2.1.1 目视检查差异图判断数据分布特点、样本浓度范围是否覆盖定量范围和筛查离群值^［1］，这些均有助于选择适当的统计方法和量化指标（差值或差值%）。采用EP09c的差异秩图（参见EP09c指南图8A、B）可确定本文1~30号数据呈恒定标准差（standard deviation，SD）分布（图1），因此选用差值作为偏倚量化指标；31-90号数据呈恒定CV分布（图2），因此选用差值%作为偏倚量化指标。全体数据构成混合变异分布（mixed variability），因为本文数据浓度跨度大（0.1~947.9），几乎跨越5个量级。依照纵坐标的不同，EP09c和EP21-A将差异图（difference plot）分为报告单位差值图（reporting units difference plot）和百分差值图（percent difference plot），可分别简称为差值图和差值%图，包括图1和图2的形式^［1，4］。有文献使用比值图（Y/X）^［15-16］，但比值在1的上下取值不对称，下侧取值01，上侧取值1∞，多呈偏态分布而不被EP09c、EP21-A和EP21-ed2使用^［1，4］。Bland-Altman图假定数据呈正态分布^［17］，属于差异图的特例^［1，15］，可能产生判断不确定性和（或）过度主观性的风险^［18-21］。

图 1 新（Y）、旧（X）批号试剂检测结果 1~30 号数据的差值秩图

图 2 新（Y）、旧（X）批号试剂检测结果 31~90 号数据的差值 % 秩图

图1和图2的数据点均形成了条带状的恒定分布，表明以第30号数据为分割点进行分段制图是正确的。在确定数据呈混合变异分布后，分段制图可同时解除横坐标和纵坐标的压缩效应（概念和缘由见下文对图3和图4的解释），更便于考察数据的分布情况以及所选数据分割点是否恰当。EP09c的差异秩图（参见EP09c指南图8A、B）横坐标的浓度值被其序号代替，因此可以解除横坐标的压缩效应，但纵坐标的压缩效应仍然可以存在：对于差值秩图，高浓度数据产生的极高差值为压缩效应产生之缘由，而差值%秩图则是源于低浓度数据产生的极高差值%。IVDR约有一半样本的被检物浓度在正常参考值范围内（基本是低值数据），这些数量众多的数据聚集于坐标轴前端的狭窄区域内，分段制图对于观察该区域的细节是十分必要的。

2.1.2 离群值的确定图1的差值秩图没有离群值存在的迹象，利用MedCalc软件的离群值探测模块（outlier detection module）的广义极端学生化偏差（extreme studentized deviate，ESD）检验，按EP09c附录B要求设潜在离群值最大个数h=1（样本量30的5%取整数），最终确定不存在离群值。图2显示第85号数据为可疑的离群值，设h=3（样本量60的5%取整数），ESD确定这是唯一的离群值。除非有明确的检测过程出错证据，否则离群值必须被保留，详见下文讨论。ESD检验假定数据主体呈正态分布，否则可通过MedCalc或SPSS的Boxplot鉴别离群值（1.53倍四分位数间距）^［22］和极端值（extreme value，3倍以上四分位间距）。

2.1.3 偏倚量化 MedCalc软件的单样本符号秩和检验提供包括单样本t检验的分析结果，是偏倚量化的有力工具^［2］。以序号30为分割点，低浓度段以差值、高浓度段以差值%进行分段偏倚量化，结果见表2。低浓度段没有离群值，可采用均值0.10（0.09~0.28）作为偏倚量化结果。但高浓度段存在一个离群值，因此采用中位数-5.0%（-7.2%，1.5%）或Hodges-Lehmann中位数-3.2%（-5.5%，-0.8%）作为偏倚量化结果。

表2 模拟示例数据的差值和差值%偏倚量化结果 n=90

浓度段（序号）	统计量	偏倚（95%CI）	可接受偏倚（AB）	结果判断
低（第1~30号）	差值均值	0.10（-0.09, 0.28）	< ±1 ng/L	A
	差值中位数	0.10（-0.10, 0.50）	< ±1 ng/L	未采用a
	Hodges-Lehmann中位数	0.10（-0.10, 0.35）	< ±1 ng/L	未采用a
高（第31~90号）	差值%均值	-2.4%（-4.7%, -0.1%）	< ±10%	未采用b
	差值%中位数	-5.0%（-7.2%, -1.5%）	< ±10%	B
	Hodges-Lehmann中位数%	-3.2%（-5.5%, -0.8%）	< ±10%	B
注：a. 图1没有离群值存在的迹象，因此采用均值即可，无需使用中位数；b. 图2被确认存在离群值，因此不宜使用均值而应该采用中位数。

EP09c的结果判断由A至E逐步变差，A和B符合要求（95%CI在AB内，对于A，还要求其95%CI包含0），C（仅单侧95%CI超出AB）和D（仅单侧95%CI在AB内）可接受，E（偏倚及双侧95%CI均超出AB）不可接受（偏倚及其95%CI全部超出AB）。IVDR临床试验是制造商为证明产品性能可以满足临床要求的确证性（validation）研究，样本量较多（EP09c推荐至少100例，实际200例以上），得出的95%CI应该较窄，建议只有A和B可被认可。由临床实验室或制造商执行的验证性（verification）研究，是为验证产品达到其标称的性能规格，样本量较少（EP09c推荐至少40例），得出的95%CI应该较宽，因而C可被接受，D虽然规则判为可接受^［1］，但建议参照EP06-ed2，若分析方法的一致性界限（limits of agreement，LoA）未超过TEa，判为偏倚可接受，否则不可接受^［23］，以排除随机误差过大的情形（见讨论）。按表2，高、低浓度段合并后全段判断为B，结论为试剂批间偏倚符合要求。

2.2 散点图的偏倚量化

回归分析被用于判断检测方法的全局偏倚，以及医学决定水平处（Xc，包括参考限^［1］和危急值）的局部偏倚，与上文差异图的全局偏倚量化功能高度重叠（但差异图还可用于总误差估算），因此在表2结果已证明试剂的批间偏倚符合要求的情况下，EP09c陈述随后的回归分析并非必需^［1］。回归分析可被用于方法学校正^［24-26］。两者功能的高度重叠，使得它们的结果之间可以相互验证。

2.2.1 目视检查散点图主要检查数据的分布形状和回归方程的拟合情况（尤其是Xc处的拟合情况）。图3数据呈一定程度的喇叭形分布，第85号数据为可疑的离群值（图2亦显示其为离群值）。高浓度段的离群值对普通线性回归（ordinary linear regression，OLR）和Deming回归影响大，加权回归（图3的P值为权重指数，定义见下文）和非参数的Passing&Bablok（P-B）回归均可抵消或降低其影响。低浓度段差值%（图1）的离群值因其实际差值很小，未必构成回归分析的离群值，除非在加权回归中赋予低浓度过高的权重。

假设本文Xc=10 ng/L和Xc=400 ng/L，则这些Xc的回归拟合情况必须被认真检查。图3显示似乎只有WLS（P=2.0）偏离高浓度数据（包括Xc=400 ng/L），其他回归线似乎均穿越Xc=10 ng/L和Xc=400 ng/L，但旧试剂和新试剂接近1 000 ng/L的高浓度数据分别导致图3横坐标和纵坐标的低浓度数据被高度压缩于坐标轴最前段很窄的区间内，掩盖了该区域的拟合情况，这是高浓度数据对低浓度数据的压缩效应，高、低浓度的量级相差越大，压缩效应越强。将X＜12 ng/L的低浓度数据分离出来形成图4（回归方程与图3完全相同），此时新、旧试剂的最高浓度在12 ng/L左右，同时解除了横坐标和纵坐标的压缩效应，可充分显示Xc=10 ng/L附近的真实拟合情况。图4显示只有P-B和WLS（P=1.4）完全穿越0~12 ng/L的数据，OLR和Deming回归完全偏离该区域，而WLS（P=2.0）几乎完全偏离Xc=10 ng/L，这些未穿越数据（尤其Xc）的回归方程所得出的结果不能反映数据的实际情况，因而不可信，不应被采用，但出于演示目的仍列出这些不可信的结果（见表3、4）。

图 3 新（Y）、旧（X）批号试剂检测结果的全局散点图

图 4 新（Y）、旧（X）批号试剂检测结果的局部散点图（X ＜ 12 ng/L）

综合图3和图4的拟合情况，只有P-B和WLS（P=1.4）回归的结果可被采用。所有模型均为y=a+b·x的线性模型（见表2）。不同模型得出的b和a可以相差很大，必须根据散点图才可从中选择可信的回归模型，这一点十分重要，否则将不能保证回归结果的正确性。

2.2.2 回归结果和分析 EP09c固定使用P=2作为加权回归权重函数的指数值^［1］，我们使用SPSS的权重估算模块（weight estimation module）确定P=1.4为最佳。非加权回归的P=0，即各处权重等于1。

表3的结果表明对于同一组数据，不同的回归方程由于它们对高、低浓度数据的拟合方式不同，其结果可以存在较大差异，应该选用图3和图4高、低浓度兼顾的方程，尤其要在Xc处有较好的拟合度^［2］。

表3 模拟示例数据（n=90）的回归结果汇总（可接受斜率为0.9~1.1）

回归模型	权重	斜率b（95%CI）	截距a（95%CI）	R2	软件
普通线性回归（OLR）		0.999（0.971~1.027）	-1.833（-9.427~5.762）	0.983	SPSS
加权线性（WLS）回归	1/xi 2	0.858（0.743~0.974）	0.437（0.354~0.520）	0.713	SPSS
	1/xi 1.4	0.977（0.948~1.005）	0.269（0.137~0.400）	0.981	SPSS
Deming回归		1.007（0.934~1.081）	-3.186（-8.446~2.074）	0.983	MedCalc
加权Deming回归	1/xi 2	无此功能	无此功能		SPSS
	1/xi 1.4	无此功能	无此功能		MedCalc
P-B回归		0.952（0.935~0.995）	0.122（-0.119~0.553）	0.983	MedCalc

P-B回归斜率0.952（0.935~0.995），WLS（权重1/x_i ^1.4）斜率0.977（0.948~1.005），均在上文可接受斜率0.9~1.1的范围内，但严格来说，斜率并不能单独使用，需要配套截距使用。若截距与最小Xc值，或AB等合理参照相比可忽略，则单独依据斜率所得的结论是有保证的，此时截距不影响所得结论。例如，WLS回归（权重1/x_i ^1.4）截距0.269相对于Xc=10可被忽略，依据其斜率0.977（0.948~1.005）在可接受斜率0.9~1.1内即可得出试剂的批间偏倚符合要求的结论。虽然表1存在0.1~1 ng/L的检测结果，截距对该范围数据的影响占比很大，但在其中增加0.269（截距）不会引起临床关注，因为此时仍远离最小Xc（10 ng/L），因此仅依据斜率得出的结论不会对临床诊疗造成不利影响。若截距不可忽略，则斜率不能代表Xc的偏倚，可通过包含截距项的表4进行评估。

2.2.3 Xc处的偏倚估计 SPSS和MedCalc可以输出Xc处的预测均值

及其95%CI，通过简单运算即可得出偏倚结果（见表4）。

表4的偏倚=a+（b-1）·x^［1］，其结果由斜率和截距完整构成。WLS（权重1/x_i ^1.4）的斜率为0.977，对Xc=10 ng/L处偏倚的贡献为（0.977-1）×10=-0.23，截距0.267与其贡献相当。在Xc=400 ng/L处斜率对偏倚的贡献为（0.977-1）×400=-9.2，截距0.267可被忽略。因此，截距对低浓度范围偏倚的贡献占比可以很大，浓度越低，截距的贡献占比越大。

OLR在低浓度的Xc=10 ng/L处的偏倚为-18.5%（-92.9~55.9%），完全超出AB（图4证实该结果不可信）。肿瘤标志物和病原体（如乙肝病毒抗原定量）等项目的Xc多数很低，而OLR常被错误地用于这类计算，因此结果极不可信。一般来说，在浓度范围跨度较大的情况下，使用OLR拟合低浓度范围的数据很可能得到误导性的结果。

OLR、WLS（权重1/x_i ²）和Deming回归方程在Xc=10 ng/L和Xc=400 ng/L处并不完全符合AB要求，甚至大幅超出，而图3和图4显示这是由于回归方程偏离Xc=10 ng/L或Xc=400 ng/L造成的，属于回归模型选择不当，并非仪器性能所致。若回归方程选择正确但仍超出AB，则是由于回归线两侧的数据过于分散所致，属于仪器性能问题，即使斜率符合要求，也应该判为偏倚不可接受。这里也说明，未经散点图（图3和图4）证实，回归结果的正确性将得不到保证，这是一个被很多IVDR研究忽视的问题。

表4显示，在Xc=10 ng/L和Xc=400 ng/L处，P-B回归的偏倚分别为-3.6%（-6.0%~1.8%）和-4.8%（-6.4%~-0.4%），WLS回归（权重1/x_i ^1.4）的偏倚分别为0.4%（-2.6%~3.3%）和-2.3%（-5.1%~0.6%），均在AB的范围内（±10%），即偏倚符合要求。综合P-B和WLS回归（权重1/x_i ^1.4）在表3和表4的结果，可以得出试剂的批间偏倚符合要求的结论，该结论得到图3、4的佐证。

如果没有更好的模型，可以使用局部准确的模型估算该局部的Xc结果（这意味着可以分别采用不同的回归模型估算不同Xc处的结果）。例如，可以采纳OLR在Xc=400 ng/L处的结果-0.6%（-2.9%~1.7%），但Xc=10 ng/L处的结果-18.5%（-92.9%~55.9%）不能被采用（因为图4已经否定其准确性），其斜率也不能被使用。

总的来说，对于回归分析，首先根据散点图确定可信模型，其次考察斜率是否在可接受范围内，最后考察Xc的偏倚是否可接受。

3 讨论

3.1 离群值的正确处置

大样本研究多有一定比例的离群值，1 000份样本约有43个2 SD和3个3 SD的离群值，检测系统性能不佳也可产生离群值，这些均属检测系统真实性能，不可剔除。若离群值的出现与性能无关，如搞混样本、转抄错误、检测过程异常（如样本体积不足、样本有气泡、仪器报警、质控失控）、违反操作规程等，则必须剔除，但也应报告未剔除前的结果^［1］。CLSI系列指南均要求尽力寻找产生离群值的原因并纠正，不允许自动排除，论述不尽相同，与研究方案、离群值的个数及可用的数据分析方法相关。

EP09c纳入离群值，采用非参数方法，差异图使用中位数估算偏倚，回归分析采用P-B回归^{［1，27-28］}。研究方案样本量中等或较大（n≥40，甚至n≥100），本身就应该有一定比例离群值。

EP21-A不允许排除离群值，此时应采用非参数法^［15］。研究的样本量较大（n≥120，多数大于200），易产生离群值，而确定总误差一般只覆盖95%的差异值，且非参数法对离群值不敏感，故无需排除。EP21-ed2放弃参数法而只使用非参数法计算总分析误差（total analytical error，TAE）以适应普遍存在的离群值，且明确规定离群值（或极端值）若非出自可确定原因的测量错误则必须保留^［4］。

综上所述，离群值若出自非性能相关的原因可被剔除，否则需保留（改用非参数统计法）。在国内文献和实际工作中，许多类似EP21和EP09的研究，尤其是体外诊断试剂临床试验直接删除离群值（占样本量的1%~5%）^［29-30］，此举无任何依据，将高估检测系统的性能，应参考CLSI系列最新指南确认、记录和报告离群值。行业标准WS/T 409-2024（临床定量检测方法分析总误差的评估）同样要求离群值只有出于错误方可剔除，否则需保留^［6］。

3.2 权重的设置和影响

非加权的OLR和Deming用最小二乘法拟合数据^［31-32］，意味着高浓度数据超比例影响回归的斜率和截距，强迫回归线穿越高浓度数据而不管低浓度数据的拟合。加权回归设置权重函数1/x_i ^P就是为降低或抵消最小二乘法对低浓度数据的忽视而强化其拟合^{［24，33］}。相较于EP09c固定P=2的加权方案^［1］，SPSS的Weight Estimation根据每份数据高低浓度的比例最大化模型的R²值，得出的最优权重更为有效。图3显示，OLR（P=0）的特性使回归线倾向穿越600~1 000 ng/L的极高浓度数据，因此得到不错的拟合优度（R²=0.983），极易误判为方程全局拟合优异，但截距-1.833（表3）导致回归线完全偏离0~10 ng/L的低浓度观察值（见图4），造成上文OLR估算的Xc偏倚出现明显偏差（表4），故EP09c声明R²不可当作评估结果一致性的指标，也不能当作线性度评价指标（R²＞0.95被用于评估样本浓度范围充分的指标之一）^［1］，而EP06-ed2要求使用WLS回归确定线性度（linearity），以避免高浓度数据的过度影响^［23］。

当P=2时，由于赋予低浓度数据过高的权重，回归线倾向穿越0~12 ng/L的低浓度观察值（见图4），但明显偏离600~1 000 ng/L的极高观察值（见图3），导致R2大幅降至0.713，因此结果不可靠。

当P=1.4时（最优权重），回归线穿越0~12 ng/L的低浓度数据（见图4），达到加权目的，同时也穿越高浓度数据（图3），因而拟合度较佳（R²=0.981），说明P=1.4恰到好处，高、低浓度兼顾，结果可靠。

虽然Weight Estimation为WLS回归的最佳搭配，但仍然需要检查散点图（图3和图4）以核实回归方程的全局（尤其Xc附近）拟合情况。

3.3 偏倚评估结论的局限性

总误差由偏倚和随机误差加合而成。偏倚主要影响临床诊断，相当于平移参考区间而导致更多误诊，随机误差（不属于EP09c的评价范畴）与结果的波动范围相关，主要影响患者的临床动态监测^［5］。因此，即使偏倚评估结论为可接受，若因随机误差过大而导致总误差过大，仍应认定两个方法的检测结果不一致，故应留意图1和图2的红色虚线±1.96 SD下标注的LoA（-0.88~1.08）和（-20.0%~15.2%）是否可满足临床要求。《体外诊断试剂临床试验指导原则》要求同时评估总误差和偏倚^［34］，可同时参考EP21-A、EP21-ed2和相关文献^［4］，采用MedCalc的Bland-Altman模块同时输出两者的结果（图1和图2）。

3.4 图形分析中的现存问题

只有形成图1和图2形式的恒定分布才可保证表2结果的正确性^［2，35］，因此高浓度段必须使用差值%而不是差值作为量化指标，而低浓度段则相反，这是图1的差值恒定分布和图2的差值%恒定分布所决定的，与总误差量化指标的选择完全相同^［2，4］，但不少IVDR临床试验报告在Bland-Altman差值图呈V型分布时仍错误地使用差值量化偏倚和LoA，将得到误导性的结论。此时的95%CI对于低浓度区间过宽，而对于高浓度区间则过窄，构筑V型的95%CI虽然可以得到正确结果^{［24，35］}，但因为缺乏配套的V型AB和V型TEa而不具应用价值。此外，当无法形成全浓度范围的恒定分布时，没有制作秩图（以此解除横坐标的压缩效应）进一步检查数据分布情况，更没有采用分段制图（图1和图2）以同时解除横坐标和纵坐标的压缩效应，导致不能深入探究数据分布，难以选择正确的量化指标，其结果和结论是值得怀疑的。

IVDR临床试验报告基本上不考虑散点图的数据分布情况，更不会制作局部散点图（图1）考察位于低浓度范围的Xc拟合情况，一律是采用OLR计算Xc及其95%CI，而表4已经显示这些结果很可能是不可靠的。

3.5 结果之间的相互验证

除了图形的确认外，表2与表3的结果之间是可以相互验证的。表3的P-B回归斜率为0.952（0.935，0.995），对应的比例偏倚等于0.952-1=-4.8%，其95%CI为0.935-1=-6.5%至0.995-1=-0.5%，因此该斜率折算为比例偏倚就是-4.8%（-6.5%~-0.5%），与表2的-5.0%（-7.2%~1.5%）相当接近，形成相互验证。同样，WLS回归（权重1/x_i ^1.4）斜率为0.977（0.948~1.005），折算的比例偏倚为-2.3%（-5.2%~0.5%），与表2的Hodges-Lehmann中位数-3.2%（-5.5%~-0.8%）形成相互验证。一些文献忽视对差值或差值%的偏倚量化^［36-37］，不提供表2的偏倚结果，仅执行回归分析且未加以核实，其结果未必可靠。

3.6 实际应用建议

根据差异图和散点图选择正确的偏倚量化指标（差值或差值%）和回归模型后，可借助SPSS和MedCalc准确快速地完成EP09c的统计分析。EP09c统计模型的计算很复杂，对公式的理解和编程很容易出错^［38］，非统计学专业的专家应该避免手工计算（包括借助Excel等非统计学计算软件），应该通过专业统计软件输出结果，以保证正确性。

需要在研究设计阶段确定可接受偏倚（AB），许多研究方案缺乏AB^［20］，仅以图1和图2的95%CI（±1.96 SD）之外的数据点个数是否小于5%判断偏倚是否可接受，这是错误的。如果数据服从正态分布，95%CI之外的数据点个数肯定小于5%，这只说明数据可能服从正态分布，无法判断该偏倚是否满足一致性标准或临床需求，只有通过将偏倚及其95%CI与AB比较才可得出正确的结论。

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