心肌不良重塑通常是指在各种病理因素作用下，心肌细胞和细胞外基质出现的细胞结构、功能、数量及遗传表型等方面的异常改变，这一系列变化导致心脏结构和功能障碍，已被公认为心血管不良事件发生的重要预测因子［1-2］。我们前期的研究表明，在一般健康人群，血脂谱异常与左心室心肌向心性肥厚存在显著相关性［3］，但其潜在的致病机制仍有待进一步阐明。流行病学研究表明，血脂代谢异常是动脉粥样硬化的最重要危险因素，其在中国人群的患病率高达35.6%，且治疗和防控率仍不理想，在经济欠发达地区尤为突出［4］。然而，目前关于血脂异常对心血管系统的危害，既往研究多关注其对远期缺血性心脏病的致病风险［5］，而较少关注其与左心室早期心肌结构不良重塑的关联。
近期临床研究表明，心肌灌注储备指数患者比健康对照组更容易发生心肌不良重塑［6-7］，提示心肌微循环损伤可能是介导心肌不良重塑的关键靶点。此外，微循环阻力指数和血脂变异性均与心肌梗死患者治疗后左心室不良重塑的发生存在相关性［8］，表明三者之间可能存在病理生理学关联。已有研究发现，在明显的动脉粥样硬化形成之前，高胆固醇水平可早期对心肌微循环就已产生不利影响［9-10］，提示血脂异常可能在冠心病发病之导致左心室结构和功能的早期改变。基于此，我们假设血脂异常可能通过心肌微循环损伤相关的组织学病理改变诱发心肌结构不良重塑。然而，据我们所知，目前血脂异常、心肌微循环障碍与左心室不良重塑之间的关联尚未得到明确阐明。本研究拟基于新西兰大白兔建立血脂异常动物模型，明确血脂异常对心肌不良重塑的影响，并进一步揭示血脂异常导致左心室心肌不良重塑与心肌微循环损伤的关联性，有望为血脂异常关联心肌损伤的早期预警和精准干预提供理论依据，具有重要的临床应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料
健康清洁级雄性新西兰大白兔20只，体质量约1.5 kg，4~6周龄，购自于北京隆安动物养殖中心，饲料购于江苏协同生物技术有限公司。主要药物及试剂：超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒购自美国Ealbscience公司，Masson染色液购自于武汉市皮诺飞生物科技有限公司、CD31购自于北京博奥森生物技术有限公司。本研究已通过本机构伦理委员会的审查批准（伦理批件号：2022062DW）。
1.2 动物分组与造模
实验兔适应性喂养3天后，采用随机数字表法随机分为两组：血脂异常组和正常对照组，每组各10只。血脂异常组饲喂高脂饲料，正常对照组饲喂普通饲料。高脂饲料配方为：10%猪油、10%蛋白粉、2%胆固醇、78%基础饲料。根据体质量变化调整进食量，以使两组实验兔的体质量保持一致。分别于实验基线、第2、4、6、8周对两组实验兔禁食12 h，检测血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）浓度。通过比较两组血脂四项水平来判定造模成功与否。
1.3 左心室心肌结构评估
所有实验兔静脉取血并完成血脂生化检测后，经耳缘静脉推注50 mL空气处死，迅速开胸取出心脏。剖开心室心腔，分离左心室心肌组织，称重3次取平均值作为左心室心肌质量。称重后，用10%福尔马林溶液浸泡固定心肌超过72 h，置于标本瓶内并做好标记。垂直于室间隔（左、右心室之间的心肌组织）平面切开心脏，测量左心室心腔的长径和短径（cm）以及室间隔室壁厚度（mm）。各指标由两位操作者测量3次，取平均值作为最终结果，数值精确到小数点后两位。
1.4 心肌组织病理检测
采用脱水包埋后，自左室中间部（室间隔）切出厚度约为5 mm的薄片并制成切片，所有标本取材位置一致，行HE染色、Masson 染色和CD31染色。Masson 染色采用SlideViewer2.5软件，选取组织的目的区域进行80倍成像，成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，Silver Spring，MD）分析软件，以单位像素Pixel作为标准单位，测量每张图片中蓝色胶原的像素面积，测量视野像素面积，计算出胶原体积分数（collagen volume fraction，CVF）百分比。公式如下：
胶原体积分数百分比（%）= 胶原像素面积/视野像素面积×100%
CD31染色采用SlideViewer2.5软件，选取组织目的区域进行80倍成像，尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。计数3个视野下微血管数目平均值作为MVD值（个/视野）。
1.5 心肌组织氧化应激标记物测定
称取左心室室间隔心肌组织约150 g，按照10%匀浆比例（相当于1 g组织添加9 mL的PBS匀浆）调配，后经10 000 r/min的速度进行离心操作，离心时间约10 min，然后取上清液检测，测定NO、MDA、GSH-Px和SOD等反映组织氧化应激水平的标志物。
1.6 统计学方法
所有数据均统一整理，采用SPSS软件包分析。采用Shapiro-Wilk检验评估计量资料，符合正态分布的计量资料以均数±标准差形式表示，不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位数）的形式表示。为比较不同饲养时间节点实验兔血脂谱浓度的差异，若数据符合正态分布，则采用单因素方差分析（ANOVA）；若不符合正态分布，则采用Kruskal-Wallis H检验。比较对照组与实验组左心室结构指标时，若数据符合正态分布，则采用独立样本t检验；否则采用Wilcoxon秩和检验。分析室间隔厚度与心肌组织标记物、饲养年龄与血脂谱浓度之间的相关性时，若变量近似服从正态分布且呈线性趋势，则采用Pearson相关分析；反之则采用Spearman相关分析。以P＜0.05为差异统计学意义。
2 结 果
2.1 不同时间点两组实验兔血脂谱
两组实验兔在不同饲养时间节点的血脂谱对比结果见图1。血脂异常组实验兔在基线、第2周、第4周、第6周及第8周时，TC、TG、LDL-C和HDL-C浓度均存在变化，且各项血脂指标与饲养时间呈正相关（所有P＜0.001）。相比之下，正常对照组在各饲养时间节点的血脂谱浓度均未见明显变化，且饲养时间与血脂指标之间无显著相关（所有P＞0.05）。
2.2 左心室心肌结构评估指标
两组实验兔的左心室结构测量指标见表1。与正常对照组相比，血脂异常组室间隔室壁厚度、心肌质量均增加（P均＜0.001）；此外，血脂异常组左心室长径和短径均略大于正常对照组，但均未达到统计学差异水平（P=0.377和0.737）。
2.3 左心室心肌组织病理学分析
HE染色示与正常对照组相比，血脂异常组心肌纤维明显排列紊乱；Masson 染色显示血脂异常组心肌纤维化水平高于正常对照组；CD31染色显示，与正常对照组对比，血脂异常组心肌微血管密度降低（图2）。血脂异常组和正常对照组MVD分别为（42±25）、（266±72）个/视野，CVF分别为（16.62±5.73）%、（4.23±1.92）%，组间均差异有统计学（P＜0.001）（图3）。
2.4 左心室心肌生化指标
两组实验兔的左心室心肌生化指标分别见表2。与正常组相比，血脂异常组心肌组织的氧化应激指标NO、SOD、GSH-Px水平降低，MDA水平升高（均P＜0.001）。
2.5 实验兔的室间隔室壁厚度与心肌组织标志物的相关性
两组实验兔的室间隔厚度与心肌组织标志物相关性见表3。对于组织病理学指标，室间隔厚度与胶原体积百分比呈正相关，与微血管密度呈负相关（均P＜0.001）；对于心肌组织氧化标志物，室间隔厚度与心肌组织NO、SOD、GSH-Px 水平呈负相关，与MDA水平呈正相关（均P＜0.001）。
3 讨 论
本研究基于动物模型证实：血脂代谢异常可导致左心室心肌不良重塑，且该作用机制与心肌微循环损伤存在关联性。具体而言，本研究以新西兰大白兔为研究对象，首先明确了血脂异常对心肌结构的不良影响，表现为与正常对照组相比，血脂异常动物模型室间隔厚度和心肌质量均显著增加；同时，本研究进一步证实了血脂异常所致心肌不良重塑与心肌微循环损伤存在关联性，表现为与正常对照组相比，血脂异常组心肌组织微血管密度及心肌氧化应激指标NO、SOD、GSH-Px水平显著降低，MDA水平显著升高，且室间隔异常增厚程度与心肌组织微血管密度减低和氧化应激标志物异常之间均存在显著线性相关性。
既往已有临床研究探讨了血脂异常对左心室结构的影响，一些影像学研究证实，血脂异常可引起左心室心腔增大和心肌质量增加［3，11-12］，这与本研究结果一致。然而，左心室心肌结构评估指标易受人口学因素（如种族、年龄、性别、体质量）、生活习惯（如吸烟、饮酒）和心血管危险因素（如糖尿病、高血压）等多种因素共同影响［13-14］。本研究通过购买统一品种及年龄的实验动物，同时通过严格控制食量等措施，有效消除以上因素对心肌的影响；此外，本研究的优势在于通过建立动物模型设立对照组，并对离体心肌组织进行严格评估，使结论更具有说服力。然而，与上述临床研究结果不同［11-12］，尽管我们的研究也证实血脂异常组左心室内径大于正常组，但差异性不显著，这可能与本研究样本量相对较小有关，因此研究，结论有待通过进一步扩大样本量或实施大规模临床队列研究加以验证。
已有临床研究证实血脂异常损伤冠脉微血管功能，表现为家族性高胆固醇血症患者微血管内皮依赖性充血反应受损，且心肌微循环损伤程度与血浆胆固醇水平显著相关［15］；此外，最近的大样本临床研究也证实，作为冠状动脉的微血管病变的评估指标，冠状动脉慢血流与血脂异常之间独立相关［16］。然而，以上研究均未系统阐明心肌微循环损伤在血脂异常介导心肌不良重塑中的关键作用。目前，有临床研究证实，冠状动脉造影衍生的微循环阻力指数是ST段抬高型心肌梗死患者血运重建术后心肌重塑的独立预测因素［17］，但血脂异常在一般健康个体心肌不良重塑发生发展的促进作用尚不明确。与前述研究相比，本研究基于动物模型对照实验，不仅进一步明确了血脂异常对心肌微循环的直接损伤作用，并证实了该心肌微循环损伤对心肌不良重塑的直接作用，具体体现在以下三个方面：首先，与正常对照组相比，血脂异常组心肌组织微血管密度显著减低，且心脏室间隔增厚程度与心肌微血管密度之间存在显著正相关，直接表明血脂异常导致的心肌微循环损伤在心肌不良重塑中的作用；此外，心肌缺血缺氧可导致大量氧自由基生成，进而导致心肌标志物水平升高［18-19］，本研究发现血脂异常组动物模型心肌氧化应激标记物NO、SOD、GSH-Px较正常组显著减低而MDA显著升高，且室间隔增厚程度与以上心肌标志物水平均存在显著线性相关性，间接表明心肌不良重塑与血脂异常介导心肌微循环损伤相关；最后，心肌微循环损伤可以通过刺激心肌细胞释放细胞或生长因子或炎症反应等途径促进心肌纤维增生过程［20］，本研究发现血脂异常组心肌胶原体积百分比显著高于正常对照组，且室间隔增厚也与心肌胶原体积百分比存在显著关联，也间接证实血脂异常导致的心肌微循环损伤在心肌不良重塑中的关键作用。
综上所述，本研究证实了血脂异常可导致左心室心肌不良重塑，且该潜在机制与血脂异常导致的心肌微循环损伤存在密切关联，本研究提示未来需要进一步探索血脂异常介导的心肌微循环损伤在心肌不良重塑的分子或细胞生物学机制，也可以为早期防控血脂异常对改善心血管疾病患者预后提供一定理论依据。本研究局限性在于样本量相对较小，未来有必要进一步开展多中心临床研究验证研究结论。
